Больше века учёные бьются над загадкой белковых агрегатов, возникновение которых в мозге (Мозг — центральный отдел нервной системы человека и животных, расположенный в головном отделе тела) аккомпанирует развитие нейродегенеративных болезней, таковых как заболевания Альцгеймера и Паркинсона. Подсказка возникла всего 10 годов назад. Выяснилось, что белки в {живых} клеточках не просто плавают в растворе. Они могут создавать капли, подобно маслу в воде. А совершенно не так давно учёные из Лаборатории биологии синапсов (Институт трансляционной биомедицины СПбГУ) нашли, что такие капли участвуют в работе нейронов при передаче сигналов от клеточки к клеточке. О том, как это открытие может воздействовать на осознание устройств нейродегенерации, мы побеседовали с заведующим лабораторией, доктором Олегом Шупляковым.
В первый раз белковые бляшки в мозге (Мозг — центральный отдел нервной системы человека и животных, расположенный в головном отделе тела) людей, при жизни страдавших особенной формой старческой деменции, были описаны в 1911 году медиком Алоисом Альцгеймером (Alois Alzheimer), чьим именованием названа эта болезнь. Позднее похожие образования нашли и у пациентов с заболеванием Паркинсона (так именуемые тельца Леви), боковым амиотрофическим склерозом (Причинами склероза могут быть разнообразные процессы: воспаление, расстройства кровообращения, нарушения обмена веществ, возрастные изменения), лобно-височной деменцией и даже травмами мозга. Но что принуждает нейроны, клеточки нервной ткани (Строение тканей живых организмов изучает наука гистология), сформировывать снутри себя эти белковые глыбы? Где и как это происходит? На этот вопросец ответа не было.
Практически через 100 лет опосля открытия доктора Альцгеймера, в 2009 году, подсказка пришла откуда не ожидали — из эмбриологии.
Открытие капель
Учёные из Института Общества Макса Планка (Дрезден, Германия) изучили строение P-гранул в зародышах возлюбленного объекта биологов — малеханького почвенного червячка-нематоды C. Elegans. P-гранулы (читается «пи-гранулы») — крохотные клеточные органеллы, представляющие из себя округленные включения в цитоплазме. Они возникают в незрелых яйцеклетках, передвигаются в клеточки зародыша при его развитии, а потом исчезают в соматических, другими словами неполовых, клеточках взрослого червячка.
Необходимо сказать, что на тот момент учёным были известны два типа клеточных органелл. Окруженные мембраной — к примеру, ядро, митохондрии, хлоропласты растений, вакуоли и везикулы. И немембранные — которые представляют собой плотные, строго упорядоченные структуры из белков и остальных макромолекул. Таковы, в частности, рибосомы, занятые в клеточке синтезом белка.
P-гранулы изумили учёных, оказавшись не тем и не остальным. Выяснилось, что эти образования из белков и РНК (Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов) ведут себя в цитоплазме клеточки как капли, по вязкости похожие на водянистый мед. Они меняют форму под воздействием тока окружающей их воды, другими словами текут, а потом опять стают круглыми. Могут соединяться друг с другом. Молекулы снутри их просто передвигаются. К тому же P-гранулы просто и стремительно обмениваются веществом с цитоплазмой клеточки. Всё это было бы решительно нереально, если б эти гранулки были окружены мембраной либо представляли собой твёрдый «кусок» белка.
Хоть какое вещество может находиться в различных фазовых состояниях. Вода быть может паром, жидкостью либо кристаллом — льдом. Буквально так же био молекулы могут находиться в различных фазовых состояниях. К примеру, белки, которые в клеточке обычно есть в виде смесей, при определённых критериях сформировывают кристаллы. Это их свойство обширно употребляется в кристаллографии, когда необходимо найти трёхмерную структуру белковых молекул. Но одно дело — учить структуру очищенного белка, и совершенно другое — заглянуть вовнутрь жив клеточки, чтоб выяснить, как в ней ведут себя био молекулы.
P-гранулы в первый раз были описаны наиболее 35 годов назад. Они находятся в эмбриональных клеточках хоть какого организма. Но с биофизической точки зрения на их глянули, можно сказать, не так давно. Практически, исследователи взяли и нажали на одноклеточный зародыш нематоды. И узрели, что при всем этом P-гранулы меняют форму, другими словами проявляют характеристики воды. Что означает «узрели»? Принудили их сиять, «пришив» к их белковой составляющей зелёный флуоресцентный белок — GFP. Перемещение молекул снутри гранул изучили с помощью технологии FRAP (fluorescence recovery after photobleaching — восстановление флуоресценции опосля фотообесцвечивания. — прим. создателя). Эта разработка сейчас встроена во почти все конфокальные микроскопы. Вы сможете нацелить микроскоп на участок клеточки, где находятся молекулы, помеченные GFP, задать его размеры и время от времени даже форму и обесцветить. Опосля этого вы можете учить, как остальные меченые молекулы, если они подвижны, туда приходят и восстанавливают «пробел».
Олег Шупляков
Давайте разделимся
Звучит просто, но эти технологии стали обширно доступны лишь в середине 1990-х годов. Весь XX век подобные открытия были просто невозможны. Результаты же исследования P-гранул принудили почти всех учёных направить внимание на образование в клеточках молекулярных конденсатов. Так были названы капли, ведь белки при их формировании конденсируются из цитоплазмы клеточки, как пары воды из воздуха выпадают росой на листья растений. В течение последующих лет выяснилось, что молекулярными конденсатами, хоть и различными по составу и вязкости, являются почти все структуры в {живых} клеточках, чья природа ранее была не ясна. К примеру, ядрышки — уплотнения снутри клеточного ядра, где происходит синтез частей рибосом. Центросома (клеточный центр) — пространство образования микротрубочек, основных частей клеточного скелета. Стрессовые гранулки — скопления РНК (Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов) и белков, которые образуются в клеточке под воздействием вредных причин: больших температур, токсинов, ультрафиолета. Перечень можно продолжать, но сущность в том, что всего за десяток лет научный взор на устройство клеточки абсолютно поменялся. Оказалось, что практически всё содержимое клеточки можно представить как повсевременно образующиеся и опять растворяющиеся молекулярные конденсаты. А может быть это поэтому, что клеточные белки способны сформировывать поверхность раздела фаз. Другими словами отделяться от водянистого содержимого клеточки, при всем этом тоже оставаясь водянистыми.
Что такое поверхность раздела фаз меж 2-мя жидкостями, проще всего объяснить на бытовом примере. Если мы нальём незначительно масла в воду и взболтаем, то масло разобьётся на отдельные шарики-капельки, но с водой не смешается. Это происходит поэтому, что молекулы воды и молекулы масла владеют различными качествами. Молекулы воды полярны. Атом кислорода в их несёт на для себя частичный отрицательный заряд, атомы водорода — положительный. Таковым молекулам комфортно находиться в компании друг дружку: водород одной молекулы притягивается к кислороду примыкающей по закону разноимённых зарядов. А вот молекулы масла неполярны, никаких приметных зарядов у их нет. И, когда молекулы воды устремляются друг к другу, они просто выталкивают чужаков из собственной уютной компании.
Порядок из кавардака
Молекулярные конденсаты, подобные P-гранулам, образованы не жирами, а белками — молекулами куда наиболее сложными и различными по строению. Не все из их в принципе могут конденсироваться таковым методом, а те, что могут, делают это только в определённых критериях. Капли формируются где и когда это необходимо клеточке.
Первичная структура белка — это цепочка аминокислот, разных по строению и свойствам. Одни несут на для себя положительный заряд, остальные отрицательный, третьи нейтральны. Потому опосля синтеза эта цепочка недолго остаётся просто цепочкой. Разноимённые заряды в молекуле притягиваются, одноимённые отталкиваются, нейтральные аминокислоты вынужденно оказываются в компании друг дружку, подобно маслу в воде. И цепочка сворачивается в спираль либо тонкий лист. Это вторичная структура белка. Спирали и листы складываются в наиболее сложные фигуры — фибриллы (нити) и глобулы (шары).
Но когда белок складывается, активные части аминокислот (боковые цепи) оказываются погребены снутри свернувшейся молекулы и не способны к взаимодействию с иными молекулами. Но может случиться так, что аминокислотная последовательность всей цепочки либо её части не даёт ей свернуться. Боковые цепи остаются открытыми и могут вступить в контакт с иной молекулой белка. Такие участки белковых молекул именуются «неупорядоченными» (intrinsically disordered regions — IDR). Конкретно они разрешают молекулам «примагничиваться» друг к другу за счёт электростатического взаимодействия и сформировывать поверхность раздела фаз.
Сейчас есть компьютерные программки, способные по аминокислотной последовательности предсказать уровень неупорядоченности белка, его определенного участка. Белковые капли в клеточках состоят из огромного количества компонент. С ходу нереально сказать, какой конкретно белок в составе капли сформировывает поверхность раздела фаз. С помощью программки, анализирующей аминокислотную последовательность белков, можно выявить белки-кандидаты. Для тестов белки метятся флуоресцентной меткой, чтоб их можно было созидать под микроскопом. Такие «улучшенные» белки могут выращиваться в микробах, дрожжах, либо в особых клеточках и потом выделяться в чистом виде. Искусственно может быть получать не лишь белок полностью, да и отдельные его участки, в том числе IDR. Таковым образом учёные могут изучить характеристики белка в пробирке и найти, вправду ли он образует капли, при каких критериях, и изучить их характеристики.
Олег Шупляков
Жонглирование «пробирками»
Для чего совершенно клеточкам необходимы эти белковые капли? Это резвый метод «огородить» пространство снутри клеточки для протекания какого-либо биохимического процесса либо хранения веществ. Капли могут быть устроены достаточно трудно. Поверхность раздела фаз образует один белок, но снутри могут находится остальные белки, РНК (Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов), даже целые органеллы. Так, клеточный центр, имеющий «капельное» строение, содержит снутри центриоли — два плотных цилиндра из микротрубочек, которые играют важную роль в делении клеточки. При всем этом условия снутри капли различаются от критерий в окружающей среде. К примеру, в ней может поддерживаться завышенная концентрация каких-либо веществ. Сила поверхностного натяжения, возникающая на границе капли, не даёт пройти вовнутрь большим белковым комплексам — а означает её содержимое защищено от деяния большинства ферментов. Проще говоря, капли, способные конденсироваться и растворяться за толики секунды — это такие «пробирки», которые у химика-природы постоянно под рукою.
Клеточка ловко управляет образованием капель. Для этого у неё есть несколько инструментов. Дело в том, что структуру белков, в том числе ту, которая дозволяет ему сформировывать капли, можно поменять. Во-1-х, белки очень чувствительны к действию температуры. Даже при маленьких её увеличениях и снижениях они способны обратимо поменять свою структуру. Также на форму, принимаемую белковой молекулой, влияет кислотно-щелочной баланс (pH). Но тоньше всего «настраивать» белок можно, меняя характеристики аминокислот, входящих в его состав. К примеру, присоединяя к неким из их фосфатную либо метильную группу. Таковой хим модификацией белков в клеточке занимаются остальные белки: ферменты протеинкиназы и метилазы.
Взаимодействие с иными молекулами снутри клеточки, не являющимися ферментами, — белками, РНК (Рибонуклеиновая кислота — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов), ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота — макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) — также способно воздействовать на способность белка создавать капли либо изменять их физические характеристики.
Ещё один принципиальный инструмент — это концентрация белка. Чтоб образовать каплю, молекулы белка должны повстречаться друг с другом. Но клеточка малая, и, хотя в ней сразу находится огромное количество различных веществ, молекул 1-го и такого же белка там быть может совершенно незначительно. Здесь в игру вступает эффект молекулярной скученности. Остальные огромные молекулы, не участвуя во содействии интересующего нас белка, занимают в клеточке место, оттягивают на себя молекулы воды и практически подталкивают белки будущих капель к контакту. Это похоже на встречу 2-ух старенькых знакомых в метро. В пустом вагоне они, быть может, и не узнали бы друг дружку либо постеснялись бы подойти. Но в час пик, будучи притёртыми чужими спинами и сумками так, что оказались лицом к лицу, они уже не могут не сказать «Привет!».
Хрупкий баланс
Все эти причины — температура, pH, локальная концентрация, хим модификация, взаимодействие с иными молекулами — употребляются клеточкой для управления каплями. Выходит достаточно непростая система. А чем труднее система, тем она уязвимей к различного рода поломкам. Неисправности в системе регуляции белковых капель угрожают тем, что белки в их не удержатся в водянистом состоянии и начнут создавать твёрдые частички.
В опытах с фотообесцвечиванием нашли, что при восстановлении капель в водянистой фазе время от времени могут создаваться твёрдые агрегаты. Нередко эти агрегаты имеют форму филаментов. Происходит это поэтому, что белковые молекулы, имеющие IDR, перебегают через определённый концентрационный барьер, при котором водянистая фаза нарушается. Если нарисовать график зависимости фазовых состояний таковых белков от концентрации, то в начале мы найдем участок, где белок будет в большей степени находиться в виде раствора, потом — в водянистой конденсированной фазе, а дальше он перебегает в плотный гель и твёрдые агрегаты. Этот переход в твёрдое состояние необратим. Концентрационный барьер, отделяющий его от водянистой фазы именуется по-английски glass/gel boundary barrier.
Олег Шупляков
Скоро появилось обоснованное предположение, что конкретно так происходит образование белковых бляшек и филаментов при нейродегенеративных болезнях. В частности, в белковых агрегатах из мозга (центральный отдел нервной системы животных и человека) людей, страдавших лобно-височной деменцией и боковым амиотрофическим склерозом (Причинами склероза могут быть разнообразные процессы: воспаление, расстройства кровообращения, нарушения обмена веществ, возрастные изменения) обнаружены составляющие стрессовых гранул. Выяснилось, что генетические мутации, нередко встречающиеся при этих болезнях, меняют характеристики белка гранул так, что он даже в критериях пробирки (in vitro) становится склонен перебегать из водянистого состояния в твёрдое. Такие переходы в лабораторных критериях продемонстрированы и для нескольких белков, издавна узнаваемых учёным конкретно связью с нейродегенеративными болезнями. В частности, для тау-белка, образующего клубки в мозге (Мозг — центральный отдел нервной системы человека и животных, расположенный в головном отделе тела) при заболевания Альцгеймера, для хантингтина, головного маркера заболевания Хантингтона, и для альфа-синуклеина, основного белка заболевания Паркинсона.
IDR белка синапсина образует капли in vitro. Добавление в среду полиэтиленгликоля (PEG) ускоряет процесс, это вещество делает в пробирке условия молекулярной скученности.
Источник: Vesicle Clustering in a Living Synapse Depends on a Synapsin Region that Mediates Phase Separation.
Когда обрывается связь
Но чтоб осознать, как развивается болезнь и как её приостановить, не много знать, что патологический белок может перебегать в твёрдое состояние из водянистого. Необходимо ответить на целый ряд вопросцев. Где в норме появляется его водянистая фаза? С какими белками он при всем этом «сотрудничает»? И, фактически, почему нейрон утрачивает весь контроль над своими молекулярными конденсатами? Конкретно на эти вопросцы применительно к заболевания Паркинсона пробуют ответить учёные из Лаборатории биологии синапсов СПбГУ при поддержке Русского Научного Фонда (РНФ).
Синапс — это пространство контакта меж 2-мя нейронами, через которое эти клеточки разговаривают друг с другом. В нём можно выделить пресинаптическую часть от передающего нейрона и постсинаптическую часть от нейрона, получающего сообщение. Пресинаптическая часть размещается на конце длинноватого отростка нейрона — аксона, который, как провод, может связывать две даже весьма удаленные друг от друга нервные (относящиеся к пучкам нервов) клеточки. Такие отростки с синапсами на концах тянутся и из чёрной субстанции среднего мозга (центральный отдел нервной системы животных и человека) в стриатум (по другому — полосатое тело). Чёрная субстанция состоит в основном из нейронов, использующих в качестве сигнальной молекулы при общении с соседями дофамин. Одна из основных функций этих нейронов — регуляция мышечного тонуса и движений. При заболевания Паркинсона синаптические связи нейронов чёрной субстанции с иными отделами мозга (центральный отдел нервной системы животных и человека), в частности, со стриатумом, нарушаются. У человека возникают соответствующие симптомы (Симптом от греч. — случай, совпадение, признак — один отдельный признак, частое проявление какого-либо заболевания, патологического состояния или нарушения какого-либо процесса жизнедеятельности) — шаткость походки, аномальное напряжение мускул, дрожание рук. В большинстве случаев это соединено с смертью дофаминергических нейронов. Четкие предпосылки их смерти до конца не выяснены. Одним из соответствующих проявлений патологии являются тельца Леви. Эти ядовитые белковые агрегаты, состоящие в основном из альфа-синуклеина, скапливаются в дофаминергических нейронах незадолго до их смерти. В обычных критериях этот белок работает в пресинаптических окончаниях. Он участвует в управлении циклом синаптических пузырьков, содержащих дофамин и выделяющих этот нейропередатчик наружу, когда клеточка передает сигнал.
Капля-передатчик
Что удалось узнать учёным под управлением Олега Шуплякова — так это то, что в работе пресинаптического окончания и в передаче сигнала меж нейронами важную роль играют белковые капли.
Если поглядеть на пресинаптическую часть нейрона в электрический микроскоп, то мы увидим, что там находится большущее число пузырьков-везикул. Они содержат вещества-нейротрансмиттеры. Главный белок, который организует эти пузырьки в малогабаритный кластер, такую «шапочку» прямо над зоной контакта меж клеточками, именуется синапсин 1. Он принадлежит к маленькому семейству белков, которые у человека, в частности, кодируются 3-мя разными генами. Всякий раз, когда нейрон передаёт сигнал, синапсин отпускает часть пузырьков. Они соединяются с мембраной клеточки, и нейротрансмиттер выходит наружу. Целый ряд остальных белков также участвуют в этом процессе, в частности альфа-синуклеин.
Длительное время была догадка, что синапсин держит везикулы в кластере, прикрепляя их к актиновым филаментам — частям клеточного скелета. Но у данной для нас догадки были слабенькие места. К примеру, некие исследования проявили, что актиновых филаментов просто нет снутри кластера. В то же время, когда аминокислотную последовательность синапсина 1 исследовали с помощью компьютерных алгоритмов, оказалось, что его «хвостик» образует неупорядоченный участок — IDR. И если этот участок получить раздельно, то in vitro он образует те же капельки. Провоцировать процесс можно повышением концентрации белка либо добавлением полиэтиленгликоля — вещества, которое в пробирке создаёт условия молекулярной скученности.
Но если синапсин образует водянистую фазу за счёт взаимодействий меж IDR, означает её можно повредить, воздействуя на эти участки. Конкретно это мы и сделали в своём исследовании. Причём, кроме исследовательских работ in vitro, мы провели опыты на {живых} нейронах, {живых} синапсах миноги. Миноги — это бесчелюстные рыбы, ведущие паразитическую деятельность на остальных рыбах. Как модельная система для исследования синапсов они увлекательны из-за особенностей физиологии (Физиология от греч. — природа и греч. — знание — наука о сущности живого).
Дело в том, что, обычно, у всех позвоночных аксоны весьма тонкие. На концах они ещё и ветвятся. И обыденный размер синапсов, расположенных на концах этих веточек, — не больше 3—4 микрон. Туда трудно «забраться». А у миног в спинном мозге (Мозг — центральный отдел нервной системы человека и животных, расположенный в головном отделе тела) есть огромные аксоны. Они не ветвятся, а идут как магистральные трубы, к которым на различных участках подступают принимающие сигнал отростки остальных нейронов — дендриты. В этих местах образуются синаптические соединения. Вовнутрь таковых циклопических аксонов можно добраться микроэлектродом и повлиять на белки, управляющие организацией синаптических пузырьков, с помощью микроинъекций активных веществ.
Мы ввели в жив синапс, находящийся в состоянии покоя, когда сигнала нет, фрагмент другого белка, который вел взаимодействие с IDR синапсина и мешал его молекулам притягиваться друг к другу. Выяснилось, что опосля инъекции этого агента пузырьки в синапсе практически «разлетаются» в различные стороны, они не могут больше удерживаться на месте. Другими словами пузырьки вправду группируются с помощью водянистой фазы, которую делает синапсин.
Какое это имеет отношение к заболевания Паркинсона? Крайние исследования проявили, что при заболевания Паркинсона патологические агрегаты может создавать альфа-синуклеин вкупе с синапсинами. Другими словами развитие заболевания может начинаться с нарушения каких-либо устройств в пресинаптическом окончании, где эти белки ведут взаимодействие друг с другом. Это открывает новейшие перспективы для осознания устройств появления патологических белковых агрегатов в нейронах и поиска молекулярных мишеней для исцеления заболевания.
Олег Шупляков
Кластер синаптических везикул разрушается опосля инъекции в аксон антитела к IDR синапсина. А — контроль, в аксон изготовлена инъекция иммуноглобулина G. B — инъекция антитела к IDR синапсина, везикулярный кластер потерян, поэтому что синапсин больше не может создавать водянистую фазу — «каплю».
Источник: Vesicle Clustering in a Living Synapse Depends on a Synapsin Region that Mediates Phase Separation.
К огорчению, на нынешний денек не существует способов ранешней диагностики заболевания Паркинсона. Почаще всего диагноз (медицинское заключение об имеющемся заболевании) ставится, когда больше половины дофаминергических нейронов чёрной субстанции уже погибли. Препараты, которые используются для терапии (терапия — процесс, для снятия или устранения симптомов и проявлений заболевания), к примеру, Леводопа — био предшественник дофамина, могут только на некое время уменьшить проявления заболевания (нарушения нормальной жизнедеятельности, работоспособности). Осознание действий, которые начинают происходить в нейронах за длительное время до возникновения наружных симптомов, сделает вероятным поиск фармацевтических средств, которые способны вправду приостановить болезнь.